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中东呼吸综合征冠状病毒实验室检测技术简述

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人气:-发表时间:2015-06-05 10:29【

中东呼吸综合征冠状病毒感染的常规检测方法是通过实时反转录PCR 反应和测序鉴定。有适当经验和生物安全条件的实验室可以尝试用细胞分离病毒检测,但不属于常规检测,本指南中未包含病毒分离的步骤。此外,鉴于我国尚无中东呼吸综合征冠状病毒标准毒株和血清学检测试剂,此版技术指南暂不包括血清学检测内容。

    任何中东呼吸综合征冠状病毒的检测都必须在适当条件的实验室由经过相关技术安全培训的人员进行操作。

目前病毒核酸的检测方法主要有检测E 蛋白上游基因(upE)、ORF1b 基因和ORF1a 基因三种。这些方法均高度敏感,检测ORF1b 基因的方法不如针对ORF1a 的方法敏感,但比其更加特异。另外,已确定了中东呼吸综合征冠状病毒基因组中位于RNA 依赖的RNA 聚合酶(RdRp)和衣壳蛋白(N)基因的几个适合测序验证的靶序列。

65.jpg

 

     在实验室要确认一个样本为阳性,需要满足以下两个条件的其中

一个:

(一)至少两种中东呼吸综合征冠状病毒特异性PCR 结果阳性;

(二)一种PCR 结果为阳性,另外一种PCR 产物序列测序,与已知序列相符。

     当针对中东呼吸综合征冠状病毒的两种不同的检测方法结果不一致的时候,应当采用反转录PCR 扩增,对扩增产物进行测序以确认检测结果。

     阴性结果也不能排除临床病人的感染,一些因素可能产生假阴性,包括:样本质量差,比如口咽等部位的呼吸道样本;样本收集的过早或过晚;没有正确的保存、运输和处理样本;技术本身存在的原因,如;病毒变异,PCR 抑制等。

     当PCR 检测结果为阴性,但临床表现和流行病学特点提示是中东

呼吸综合征冠状病毒感染时,可采用血清学方法进行检测。双份血清

标本能够满足血清学检测的要求。

 

荧光定量PCR 方法检测中东呼吸综合征冠状病毒核酸标准操作程序

1、目的

  规范荧光定量PCR 方法检测中东呼吸综合征冠状病毒核酸的工

作程序,保证实验结果的正确可靠。

2、范围

  适用于荧光定量PCR 方法检测中东呼吸综合征冠状病毒核酸。

3、职责

检测人员:负责按照本检测细则对被检样本进行检测。

复核人员:负责对检测操作是否规范以及检测结果是否准确进行

复核。

部门负责人:负责对科室综合管理和检测报告的审核。

4、样本接收和准备

4.1 核对被检样本姓名、性别、年龄、编号及检测项目等。

4.2 待检样本的状态如有异常,需注明。

4.3 待检样本应存放于-70℃。

5、本方法检测项目为中东呼吸综合征冠状病毒核酸测定(荧光

定量PCR 方法)

6、检测仪器设备和材料

6.1 荧光PCR 检测仪(ABI7000 或相似性能产品)

6.2 计时器

6.3 德国VITLAB移液器(10μl,100μl,1000μl),准确度±2%

6.4 微型振荡器

6.5 一次性手套

6.6 含氯消毒剂

7、检测环境条件

实验应在20℃-25℃室温中进行。

8、诊断试剂和材料

8.1 引物和探针:

upE:

upE-Fwd 5’-GCAACGCGCGATTCAGTT-3’

upE-Rev 5’-GCCTCTACACGGGACCCATA-3’

upE-Prb 5’FAM-CTCTTCACATAATCGCCCCGAGCTCG-TAMRA 3’

ORF1b:

ORF1b-Fwd 5’-TTCGATGTTGAGGGTGCTCAT-3’

ORF1b-Rev 5’-TCACACCAGTTGAAAATCCTAATTG-3’

ORF1b-Prb 5’FAM-CCCGTAATGCATGTGGCACCAATGT-TAMRA 3’

8.2 QIAamp Viral RNA mini kit

8.3 PCR 反应管:96 孔PCR 反应板和透明封膜或PCR 反应管和透

明盖。

8.4 DEPC 水

8.5 AgPath one-step RT-PCR kit

9、检测原理

Taqman 荧光探针为一段特异性寡核苷酸,两端分别标记一个荧

光基团和一个淬灭基团。探针完整时,荧光基团发射的荧光被淬灭基

团吸取;而PCR 扩增时,聚合酶的5’-3’外切酶活性将探针切断,

使荧光基团和淬灭基团分离,发射荧光。每一分子的产物生成都伴随

着一分子的荧光信号产生,通过对荧光信号累积的监测实现对整个

PCR 过程的实时监测。该方法由于靶序列由引物和探针双重控制,特

异性好,假阳性低。

10、检测步骤

10.1 病毒核酸(RNA)的制备:

10.1.1 样本要求:咽拭子(或其他呼吸道样本);全血或血清。

10.2 准备提取试剂(在使用前进行):

10.2.1 Buffer AVL 工作液的制备

将试剂盒提供的Buffer AVL 液1ml 加入到1 管冻干的Carrier

RNA 中, 混合均匀, 彻底溶解Carrier RNA。在第1 次使用前将溶解

的Carrier RNA 加入到1 瓶Buffer AVL 中, 制成Buffer AVL 工作液,

保存于2-8℃(稳定性为48 个小时)。在2-8℃条件下, Buffer AVL/

Carrier RNA 混合物可能会析出沉淀, 可在使用前80℃温育使之融

解。

10.2.2 Buffer AW1 工作液的制备

试剂盒中Buffer AW1 以浓缩液的状态提供。第1 次使用前, 按

照试剂瓶上的说明向其中加入规定量的无水乙醇制备成工作液。

Buffer AW1 工作液在室温条件下可稳定保存1 年。

10.2.3 Buffer AW2 工作液的准备

试剂盒中Buffer AW2 以浓缩液的状态提供。第1 次使用前, 按

照试剂瓶上的说明向其中加入规定量的无水乙醇制备成工作液。

Buffer AW2 工作液在室温条件下可稳定保存1 年。

 

10.3 病毒核酸(RNA)提取步骤:

所有试剂在使用前应平衡至室温;所有离心步骤应在室温下进

行。

10.3.1 取n+1 个1.5ml 灭菌塑料离心管, 作好标记。n=样本数

10.3.2 每个塑料离心管加560ul Buffer AVL 工作液。

10.3.3 将140ul 待测样本及对照样本加到上述离心管中,振荡

混匀15 秒, 室温孵育10 分钟。

10.3.4 短暂离心后加入560μl 无水乙醇, 振荡混匀15 秒, 再

短暂离心。

10.3.5 取步骤10.3.4 得到的混合物630μl,加入到QIAamp RNA

提取柱中(带有2ml 的集液管), 盖上管盖,6000×g 离心1 分钟。

10.3.6 更换新的集液管, 将10.3.4 剩余的样本加入到QIAamp

RNA 提取柱中,盖上管盖,6000×g 离心1 分钟。

10.3.7 更换新的集液管, 打开管盖, 加入500ul Buffer AW1 工

作液,6000×g 离心1 分钟。

10.3.8 更换新的集液管, 打开管盖, 加入500ul Buffer AW2 工

作液,20000×g 离心3 分钟。

10.3.9 更换新的集液管, 20000×g 离心1 分钟。

10.3.10 将QIAamp RNA 提取柱置于新的1.5ml 离心管上, 小心

的打开管盖, 加入60μ1 洗脱液Buffer AVE, 盖上管盖, 室温条件

下孵育1 分钟, 6000×g 离心1 分钟, 收集滤出液, 做好标记, 4℃

保存备用。

10.4 荧光定量PCR 检测:

10.4.1 荧光定量RT-PCR 反应液的准备:

每个待检样本反应液的组成为:

2×RT-PCR buffer:12.5μl

25×RT-PCR enzyme mix:1μl

引物(5mM):各1μl

探针(5mM):0.5μl

Detection enchancer:1.67μl

加水至20μl

10.4.2 每反应管中加入待检核酸5μl,盖紧管盖或封好透明膜,

置于PCR 检测仪上。

10.4.3 扩增条件设定:

45℃,10min;95℃,10min;95℃,15s,60℃,1min,共40 循环。

10.4.4 仪器检测通道选择:

使用ABI7000 荧光PCR 检测仪时选择Fam 荧光信号,收集设在

60℃。具体设置方法请参照各仪器使用说明书。

10.4.5 结果分析阈值设定:

使用ABI7000 荧光PCR 检测仪进行结果分析时,基线(baseline)

取3-10 或6-15 个循环的荧光信号,阙值设定原则以阙值线刚好超过

正常阴性对照品扩增曲线的高点,也可根据仪器噪音情况调整。

11、荧光定量RT-PCR 反应系统的质量控制:

反应结果应同时符合以下3 个条件,否则试验结果无效。

11.1 阴性对照:无扩增, 为阴性。

11.2 强阳性对照:Ct 值<25。

11.3 临界阳性对照:Ct 值<35。

12、结果判断:

12.1 阴性: 无Ct 值或Ct 为40。

12.2 阳性:Ct 值<37, 可报告为阳性。

12.3 Ct 值在37-40 之间的样本建议重做, 若重做结果Ct 值< 37,

该样本判断为阳性, 否则为阴性。

 


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